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ClinOralInvest：（21）:–
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1.关于乳牙的牙体牙髓治疗，什么时候做根管治疗？什么时候做活髓切断？
2.牙髓颜色，出血量，止血的难易度如何评估，有没有较为客观的指标？有没有文献支持？
根管·牙髓的血液颜色是判断乳牙牙髓临床状态和血液组织学状态的有效指标
原文标题：Pulpbleedingcolorisanindicatorofclinicalandhistohematologicstatusofprimaryteeth
原文作者：NaserAslAaminabadi；MarziyehParto；ParyaEmamverdizadeh；ZahraJamali；SajjadShirazi
编 者：高艳霞
责任编辑：汪 鹭
摘要乳牙牙髓治疗的成功取决于诊断准则的可靠度，适合的药物及技术。如何选择适合的治疗方式，准确诊断牙髓炎症的状态至关重要。
判断牙髓状态，最准确的方式是组织学检查：能判断炎症的程度以及是否存在坏死。然而，牙髓的组织学检查在临床上很难操作，接近于不可能。因此，临床操作者必须依靠细节化的临床指征和影像学指标。对这些指标的评估必须建立在扎实的经验文献基础之上，以决定用何种方式治疗。无论是恒牙还是乳牙，关于临床指征与牙髓组织组织学状态的关系的研究都很少。以往有文献提出，恒牙牙髓组织学的表现与其临床症状和影像学指征相关。在乳牙方面，结论是有争议的。而且，缺乏综合性的研究。
另一方面，从临床操作来看，露髓时露髓孔的大小，牙髓的表观，出血量多少都是判断牙髓状态的有价值的观察指标。
本研究想要回答如下问题：血液组织学的改变以及牙髓出血的颜色与临床指征和牙髓组织学状态有关吗？如果有关，牙髓出血颜色可以作为可行的诊断牙髓状态的指标吗？
关键词：血细胞计数；牙体牙髓疾病；Giemsa染色；组织学技术；乳牙
目的：探求乳牙牙髓血液的颜色及相关血液组织学指标是否与患牙临床特征及牙髓的组织学改变相关，牙髓出血的颜色是否可作为有效的指征指导临床治疗方案的选择。
研究路线原图
汉化
说明1）共名患者，颗乳牙，年龄3-6岁。
2）颗牙齿进行了牙髓摘除术；
3）57颗牙齿龋源性露髓后进行了活髓切断（露髓孔范围大于1mm）；
4）46颗牙齿机械露髓后进行了活髓切断（露髓孔范围小于于1mm）；
5）露髓后用毛细管采集髓腔血液，用以进行颜色及血液组织学检测。
6）取出冠髓和根髓组织，以进行组织学分析。
7）参与筛查的人群：年8月至年5月，常规牙科检查的3-6岁儿童。
8）纳入标准：
健康状况好，没有系统性疾病，无过敏史，没有使用特殊的局部用药或全身用药；
至少有两颗有活力的深龋牙齿，一颗适合做活髓切断，（至少）一颗适合做牙髓摘除术；
牙齿残余结构适合用银汞充填或不锈钢金属冠修复；
有或无自发痛史；有或无病理性动度；有或无前庭区的红肿；有或无触痛；
没有牙根的病变；没有继承恒牙牙囊的病变；
家长的知情同意。
预试验及样本量估算预实验数量是20颗牙齿，或进行活髓切断，或进行牙髓摘除术。预试验的病例并未包含在主试验中。
考虑到两组血液颜色（a值）的15%差异，α=0.05，power=80%，要求每组的病例为40例，据此增为46例，以改善研究的效能，弥补有可能的脱失。牙髓摘除术组的样本量双倍增长，作为对照组。
图1SpectroShademicrosystem.
临床步骤由儿童牙科学的1名硕士生在有经验的儿童牙医指导下进行所有的临床操作。
经治牙接受麻醉，高速涡轮伴大量水冲洗打开入口，用钨钢球钻慢速涡轮去除龋齿腐质，先去除所有的周边腐质，然后再进行有可能露髓的牙本质清除步骤。
用橡皮障隔离牙齿，以保证局部清洁。
使用挖匙或低速涡轮的钨钢球钻揭开髓腔顶，不喷水。将髓腔内血液收集于2支直径相似的肝素化的毛细管中，用于做血液成分分析及颜色分析。
关于治疗方法（活髓切断或牙髓摘除术）的选择，遵循AAPD的指南，基于临床上的观察和对症状体征的仔细评估。去腐导致露髓或机械（意外）露髓时采取活髓切断。所以活髓切断病例被分为两组：龋源性露髓组（露髓孔1mm）和机械源性露髓组（露髓孔1mm）。在这些病例中均使用挖匙切断冠髓。
发生了不可逆性牙髓炎时，或者用生理盐水湿棉球按压5分钟仍未止血时，采取牙髓摘除术。使用拔髓针取出根髓。
记录治疗方式，自发痛，激发痛。
治疗完成。
实验室和组织病理学步骤牙髓样本及血液混合层的的预备处理由实验室人员完成。切除掉的牙髓组织被立即放置入10%缓冲福尔马林液中24h。样本被放置于处理器中22h，分层处理为4μm层厚后，用苏木精伊红染色。
牙髓炎症的等级被分为无，轻度（感染细胞25个），中度（感染细胞为25-个），重度（感染细胞个）四级。
同时记录牙髓组织的钙化度。
图2不同炎症程度及钙化的显微镜下观
a图：中度感染b图：重度感染
c图：多形核细胞（黑色箭头）和单核细胞（红色箭头）d图：牙髓组织的钙化（黑色箭头）
取出一滴牙髓血液的混合层血液样本后立即处理，载玻片采用Giemsa染色。在放大倍下进行不同的血细胞计数，以血液百分比形式计数。
采用光学显微镜检查所有的载玻片。20天后，随机选取40个载玻片进行重新计数WBC数和炎症细胞数，以验证实验的可靠度。
血液颜色评估将牙髓血液采集至毛细血管后被立即盲测定血液颜色。固定血液样本于相机前，将白背景板放于试管后方，以阻止光的折射。
在图1所示的系统中，血液的颜色通过L值和浓度来确定。暗红的血液颜色L值低，a值低。将微管中的血液按高度分为四部分，每部分分别检测L，a，b值。平均值作为最终分值。牙髓血液颜色的差别通过如下公式得出。
在标准情形下，ΔE等于1的变化值可以被一半的观测者察觉到。临床上把ΔE的变化值3.3设为临床可感知阈值。
统计分析数据形式包括均值，标准误，百分率等。Kolmogorov–Smirnov测试和Q-Q散点图以确定数据的正态分布。结果分析软件采用SPSS22，同时检测检查者内及检查者间的可靠度。
结果图3不同治疗组及髓腔不同炎症组的血液颜色有显著差异
A牙髓摘除术组B龋源性露髓组C意外露髓组
D重度炎症组E中度炎症组F轻度炎症组
图4不同治疗组及不同炎症程度组的红细胞计数及白细胞计数比较
图5不同治疗组及不同炎症程度组的血细胞组成比较饼图
表1不同治疗组的血细胞计数比较分析
表2不同治疗组的组织学分析比较及钙化频率比较
表3不同炎症程度的自发痛，激发痛，牙髓钙化分布差异
结果概述1）牙髓摘除术组以及重度感染的牙齿，其牙髓血液颜色明显更暗一些。这些明暗差别能从临床上被肉眼感知到。（图3）
2）白细胞计数与血液颜色之间存在明显负相关。
3）各治疗组间的中性粒和淋巴细胞数显著不同。（表1）
4）冠髓部炎症不同阶段组，白细胞，噬酸粒，单核细胞，中性粒，以及噬碱细胞在均有明显不同。（图5）
5）重度感染出现在在牙髓摘除术组的比例比活髓切断术组更高。（表2）
6）牙髓摘除术组的牙髓钙化比例更高。（表2）
结果之血液颜色研究不同治疗组间，血液颜色的L值和a值有显著差异。牙髓摘除术组的L值和a值最低。意外露髓组的L值和a值高于龋源性露髓组。
冠部牙髓感染的不同程度组间，其血液颜色的L值和a值也明显不同。严重感染组的L值和a值最低。WBC计数与L值，a值呈显著负相关。
牙髓摘除术组与意外露髓组，牙髓摘除术组与龋源性露髓组，意外露髓组与龋原性露髓组的Eab差值分别为7.97，3.88和4.65。合并两组活髓切断组后，差值是5.37.因此，牙髓血液颜色的差异是可以在临床中被裸眼感知的。
严重感染组与轻度感染组的Eab差值为10.92。重度与中度的差值为6.95。中度与轻度差值3.97.据此，不同冠髓炎症程度的牙髓颜色差异也可被肉眼感知。
结果之血液组织学计数不同治疗组间，红细胞计数（p=0.01），中性粒细胞百分比（p=0.），淋巴细胞（p=0.01），单核细胞（p=0.03）和碱性粒细胞（p=0.01）有显著差异。经过Bonferroni-Holm修正后，只有中性粒比率和淋巴细胞比率有显著性。白细胞计数（p=0.06）和噬酸细胞比率（p=0.4）不显著。
在冠髓炎症程度不同的牙齿组中，有显著差异的细胞数包括：白细胞计数比率（P=0.），嗜酸性粒细胞比率（P=0.），单核细胞比率（P=0.），中性粒细胞比率（P=0.04），碱性粒细胞比率（P=0.）。经过Bonferroni-Holm修正后，只有白细胞计数比率，嗜酸性粒细胞比率，单核细胞比率，中性粒细胞比率，碱性粒细胞比率有显著差异。RBC之间无显著差异，淋巴细胞比例也无差异。（表1）
结果之组织病理学不同治疗组间，冠部的炎症程度有显著差异。牙髓摘除术组最容易出现重度感染。龋源性露髓组中最常发现中度感染。获得的99例根髓组织中，冠髓根髓组织发现无差异，最常出现的是重度感染。
冠髓的钙化程度在不同治疗组间差异明显。牙髓摘除术组中51.9%的病例出现了钙化。此外，严重感染组中冠髓的钙化比例更高。
自发痛更容易出现于重度冠髓炎症组。激发痛的频率并无差异。（表3）
回归分析多因素回归分析结果显示，L值，RBC计数，冠部炎症程度，牙髓组织钙化程度有显著性。与此结论相一致的是，与意外露髓相比，牙髓摘除术组血液颜色更暗，更易出现牙髓组织钙化。与龋源性露髓组比较时，牙髓摘除术组的血液颜色更暗，钙化程度更高，更少的RBC计数。
结论考虑到牙髓切断术和活髓切断术牙髓血液颜色的显著差别，以及不同牙髓炎症状态间的血液颜色区别，血液的颜色能作为判断牙髓状态的有效临床指标，可用作指导采取适合的牙髓治疗方式。
讨论1.影响临床决策的因素及其可靠度
1）现状：
牙髓炎分为可逆性牙髓炎与不可逆性牙髓炎，（也有称为早期牙髓炎与弥散性牙髓炎）
不可逆性牙髓炎最好进行牙髓摘除术。但可逆性牙髓炎与不可逆牙髓炎的区分很难，尤其是对于儿童病人乳牙牙髓状态的判断在准确性方面还差强人意。
临床上多半是根据主诉（是否存在自发痛，激发痛，病程长短等），进行详细的临床检查，必要时采用牙髓活力测试，辅助影像学检查等综合判断，但是1））对儿童进行的牙髓活力测试并不可靠。2））儿童的主诉也不能完全相信。3））影像学检查对于较前期的病变并不能显示出显著差异。
在此情况下，露髓后的出血量，出血颜色及止血的难易程度可被作为牙髓状态判断的重要指标。然而，出血颜色的程度与牙髓组织学状态之间的关系尚未有研究。
2）从组织病理学角度，炎症程度如何才会被定义为不可逆性牙髓炎？
本研究通过炎症细胞计数对冠髓炎症进行了评估。我们的实验结果说明：不同治疗组的牙齿，其冠髓的炎症程度有显著差异。冠髓钙化程度也显著不同。牙髓摘除术组中牙髓钙化的频率和重度感染的比例更高。大部分活髓切组的感染程度为轻度或中度。之前有研究提出，长期的龋损引起的炎症改变会导致髓腔组织的钙化。Sheykhrezaee等人指出，弥散性的或多源的钙化可被看作是髓腔内低氧和细胞凋亡的结果。这些研究都与本研究相一致，牙髓摘除术组，低氧血状态及血液颜色变暗，以及更高比例的牙髓钙化。
此外，牙髓摘除组的冠髓与根髓的炎症程度并无差异。因此，考虑到根髓内炎症的分布，对这些病例进行牙髓摘除术是正确的诊疗方案。另一方面，炎症严重病例的显著变暗的血液颜色也验证了血液颜色可作为一个有效的指标。
除此之外，自发痛更容易出现于重度炎症的病例。但激发痛并无显著差异。尽管一些研究认为髓腔内的疼痛与炎症程度相关，但其他研究并未发现疼痛症状与髓腔内组织炎症表现的相关。而且，还有一些其他研究指出，由激活的牙髓淋巴细胞所分泌的炎症介质，包括前列腺素，IL-1，以及组胺，进一步介导了痛觉神经的传递，从而产生痛觉。此外，牙髓或根尖周组织炎症引起的痛觉过敏和异常性疼痛都会造成这些临床症状。
3）从血液成分学来说，是否中性粒细胞比率增加，淋巴细胞比率降低-可提示牙髓摘除术？
在我们的研究中，不同治疗组间的WBC计数未发现显著差异。然而，牙髓摘除组的中性粒细胞比率显著增高。根据这一类似结论，Guthrie提出，牙髓内中性粒细胞增高的牙齿不适合做牙髓保留活性治疗。之前有人指出，在不可逆性牙髓炎中中性粒细胞的作用不可小觑，深龋的正下方或者接近露髓点都有明显的中性粒聚集。推测有三种机制：1））细菌产物的效应，这些产物吸引中性粒，而不吸引其他淋巴细胞。2））IL-8的分泌，由成纤维细胞分泌，吸引了中性粒的聚集。3））IgG复合体偶联CD16，引起中性粒聚集和脓肿形成。
Guthrie还发现，在局限的龋源性露髓牙齿中，淋巴细胞计数正常或增高。与此类似，我们也发现，意外露髓，穿髓孔直径小于1的牙齿病例，淋巴细胞比率增高。这一发现的可能原因是：TGF-β的作用。在感染初期（可逆性牙髓炎）炎症处于发展期，吸引免疫细胞，如淋巴细胞等。在慢性炎症或不可逆性牙髓炎中，TGF-β显示出了抗炎效果，抑制淋巴细胞的增生。因此，淋巴细胞是可逆性牙髓炎中的主要内源性起效细胞。这也是为什么我们在牙髓摘除组中发现的淋巴细胞比率低的原因。后者处于不可逆性牙髓炎。
我们的研究中牙髓摘除组淋巴细胞比率为51.15%，明显低于活切组。按照这个思路，Sunada建议，当冠髓血像中淋巴细胞比例低于57%时，保留牙髓活力的治疗是不够的。有趣的是，我们研究中意外露髓组的病例淋巴细胞比率为58.39%，被Sunada的建议所支持。
另一方面，严重感染的报细胞计数显著增高。以往曾有人提出，内皮细胞黏附性增加会显著增加淋巴细胞的溢出，多为多形核细胞（酸性粒，中性粒，碱性粒）和单核细胞。这项研究与我们的观察相一致:严重感染的髓腔，酸，碱，中性粒增加。
4）关于血液颜色指标的提示意义：
在本研究中，不同治疗组之间的牙髓血液颜色有显著差异；不同冠髓炎症程度的牙髓颜色也有显著差异，提示牙髓出血的颜色可作为指标判断牙髓炎症状态及指导治疗方案选择。但具体数值，以及如何避免个体的主观差异尚需进一步研究。
2．血液颜色的影响因素
血液颜色的影响因素有：血红蛋白水平和血红蛋白分子中的氧饱和度。每个血红蛋白分子包含四个亚铁血红素组，他们与氧原子的交互作用改变着血液颜色。动脉和毛细血管中的血液（富含氧）是亮红色，因为亚铁血红素在氧的作用下呈明显的红色。而静脉血呈暗红色。一些疾病和因素，二氧化碳，Ph值，温度都可以影响携氧能力，从而影响血液颜色。
本研究中，只有身体健康的孩子纳入研究。假定纳入儿童的HB水平在正常范围内。因此，不同患者间Hb的水平不会造成血液颜色的明显差异。
3.炎症与血液颜色的关系
炎症和细菌产物，包括脂多糖，脂磷酸壁，会激活牙髓细胞内血管内皮生长因子促其浓度升高。VGEF（血管内皮生长因子）被证实可以提高血管通透性，因此导致血容量增长，以及液体分泌。这种分泌又导致组织压力上升，血流量下降，血液流动停止，组织低血氧，组织退行性变，紧接着温度升高，厌氧代谢增加。这些过程都导致了血红蛋白氧亲和力的下降导致氧原子的解离，因此血液颜色变暗。
因此，牙髓摘除术组血液颜色较暗，是由于炎症产物增加，血液流动停滞，Ph值下降，温度增高，血红蛋白的氧合度差等因素导致的。
Shibata等人研究血液透析病人还发现，血液颜色（a值），与WBC计数及氧饱和度负相关。他们还发现，感染是影响血液颜色的重要因素之一。有趣的是，我们也发现了WBC计数与血液L值a值的负相关。而且，严重牙髓感染的病例中L值a值较低。
4.血液颜色的主观差异
需要进一步指出的是：我们计算了以颜色差值衡量血液颜色的个体感知差异。牙髓摘除术组与活髓切断组，不同炎症程度组，各组间ΔE值都超过了3.3.这意味着不同治疗组建的血液颜色差异能被人眼所识别。正如猜想的那样，ΔE的最大差异出现于牙髓摘除术组与意外露髓组。ΔE的最大差值也出现于重度感染组与轻度感染组。再一次提示：牙髓血液的颜色可被作为一个有效的可靠的指标，以促进准确地进行牙髓摘除术或活髓切断术。
5.本研究的局限之处在于：
1）需要进行长期的后续研究，以评估使用血液颜色作为治疗选择的后续效果。
2）尽管我们的研究认为不同治疗方案选项组的血液颜色能被肉眼所区分，但还需要进一步的研究以评估机器设施数据与人眼评估之间的一致性。
篇首问题：
1.关于乳牙的牙体牙髓治疗，什么时候做根管治疗？什么时候做活髓切断？
理论上，弥散性牙髓炎，不可逆性牙髓炎，根髓有炎症的，需要进行牙髓摘除术（根管治疗）。
如果炎症范围局限于冠髓内可进行或随切断术。
临床上可借鉴的指标包括：自发痛，病程长短，影像学检查，露髓孔大小，出血量，冠髓切除后止血的难易程度等。
2.牙髓颜色，出血量，止血的难易度如何评估，有没有较为客观的指标？有没有文献支持？
一般来说，鲜红色，穿髓孔小于1mm，湿的生理盐水棉球压迫5min内能止血的，都可以尝试进行或随切断治疗，但客观性不够。
本研究中提出的牙髓出血颜色（L值，a值），以及中性粒细胞比率，淋巴细胞比率等，或许可以期待后续研究确定其可靠度，以判断牙髓的炎症程度，指导治疗方案的选择。
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