本文原载于《中华骨科杂志》年第12期
大约70%的成年人一生中将会发生腰背部或颈部疼痛，给患者带来极大痛苦，而且大部分患者因此丧失劳动能力，给社会带来巨大的经济损失[1,2,3]。椎间盘退行性变（椎间盘退变）是引起腰背部疼痛的重要诱因[4]，退变最早发生于髓核，髓核细胞数量下降和细胞外基质改变是退变的早期病理基础[5]。
压力和低氧的微环境是导致椎间盘退变的重要因素，除了会造成椎间盘组织损伤，还会干扰椎间盘的内源性修复，使退变难以自行逆转[6]。椎间盘干细胞是椎间盘内天然存在的干细胞，具有间质干细胞(mesenchymalstemcells,MSC）特性，在内源性修复中扮演重要角色[7,8]。随着退变的进展，椎间盘内细胞数量会逐渐减少[9,10]；我们曾报告过度压力会导致椎间盘内干细胞、髓核细胞数量减少[11,12]。但是压力及低氧与椎间盘干细胞的关系，以及导致椎间盘干细胞减少的机制目前还不明确。
以干细胞为核心的生物学治疗是椎间盘退变治疗研究中最具前景的发展方向之一[13,14]。一种研究思路是向椎间盘内补充外源性MSC，并诱导其分化为椎间盘内细胞，进而实现椎间盘的修复和再生；另一种思路是募集更多的椎间盘干细胞进入椎间盘内。但这两种思路亟待解决的瓶颈均在于难以持续向椎间盘内提供数量充足的干细胞，并帮助其应对不利微环境造成的消耗[15]。因此，维持椎间盘内干细胞数量及质量是椎间盘内源性修复的关键。
本文以"间质干细胞"、"mes-enchymalstemcells"、"椎间盘干细胞"、"Intervertebraldiscstemcells"、"椎间盘组织工程"、"Intervertebraldisctissueengineering"、"退变"、"degener-ation"、"水凝胶材料"、"hydrogel"等作为检索关键词在Pubmed、Embase、webofScience、中国知网数据库进行检索，检索语种限定为中文和英文，限定检索结果为针对椎间盘退变的相关研究。文献纳入标准：①文献类型为期刊论文、学位论文、综述；②文章研究内容与椎间盘内源性修复失效机制密切相关；③同一领域选择近期发表或发表在权威杂志上的文章。排除标准：①非英语的外文文献；②内容重复的文献；③无法获得全文的文献。最终45篇文献纳入本研究，其中基础研究相关文献38篇，临床研究文献0篇，综述及其他文献7篇；中文文献8篇，英文文献37篇（图1）。对最终筛选出的文献按照椎间盘退行性变机制研究及椎间盘组织工程研究进行分类。本文旨在归纳近年来关于椎间盘内源性修复领域的研究现状及最新研究进展，为今后的相关研究指明方向，为椎间盘退行性变早期治疗提供新的思路。
图1
文献选择流程图显示最终纳入文献45篇（中文文献8篇和英文文献37篇）
一、椎间盘干细胞用于椎间盘修复的潜力
椎间盘的髓核、软骨终板和纤维环内均天然存在干细胞，鉴于这些干细胞均能表达MSC系列标志物，如OCT3/4、CD90、Stromalcellsantigen1（STRO-1）等，具有高度同源性，且有研究揭示其自干细胞巢向椎间盘内迁移的路径（图2），这些干细胞可以被视为同一种细胞（椎间盘干细胞）在迁移进入椎间盘过程中处于不同环境或分化阶段的细胞[16,17]。本课题组前期研究中也在兔椎间盘的髓核、软骨终板、纤维环及干细胞巢区域（纤维环的外缘连接相邻椎体的终板或软骨膜处）分离、培养和鉴定出椎间盘干细胞。
图2
椎间盘干细胞巢及干细胞迁移路径示意图。左图中细胞分布密集区1部位细胞分布密集，为干细胞巢所在；细胞分布密集区2部位细胞分布较分散且形态上更加成熟；箭头所指为椎间盘干细胞迁移方向。右图为左图局部放大[19]
随着年龄及退变程度的增加，椎间盘内干细胞数量明显下降。此外，在可控轴向压力致兔腰椎间盘退变模型研究中采用BrdU染色观察压力对干细胞迁移影响，发现在较小的持续压力刺激下，干细胞向椎间盘内迁移明显增加，在较大压力下迁移却明显减少。该研究及其他文献报道均提示对压力等微环境因素引起的损伤，干细胞会迁移进入椎间盘进行自我修复，但其修复也会受环境因素干扰甚至失效[7,18]。因此，研究受损椎间盘如何募集干细胞，以及干细胞迁移受不利微环境干扰的机制，有助于加深对椎间盘自我修复失效的理解。
目前，椎间盘退变生物学治疗使用的干细胞可分为两类，一类是从机体分离出的外源性MSC，第二类是椎间盘干细胞（内源性干细胞）。国外文献及本课题组均报告了利用外源性MSC结合组织工程学技术治疗椎间盘退变的可喜进展[20,21,22]。年Pattappa等[23]报告募集内源性干细胞可促进椎间盘修复，展现出椎间盘干细胞用于椎间盘退变治疗的巨大潜力。但这两种思路均面临在椎间盘内不利微环境下如何长期维持干细胞数量充足且活性良好的瓶颈[24]，因此，需要结合干细胞受不利环境影响的机制及干细胞的应对机制研究，寻求能够发挥椎间盘干细胞修复退变潜力的新策略。
二、压力和低氧等微环境对椎间盘干细胞迁移的影响
椎间盘干细胞向椎间盘内迁移是补充椎间盘干细胞数量和质量的重要途径之一[17]。干细胞向受损组织迁移是一个动态过程，受一系列复杂机制调控，涉及到细胞因子、细胞间互动、细胞内信号转导乃至细胞内结构（如线粒体和细胞骨架等）的互动[25]。
已有文献报道髓核细胞可分泌一些诱导MSC趋化的因子，如HIF-1α、VEGF、SDF-1(stromalcellderivedfactor-1)、CCL5[chemokine（C-Cmotif）ligand5]等[23]。同时，干细胞也会对趋化因子做出响应，例如年Pattappa等[23]报告MSC在退变椎间盘条件培养基刺激下，表达趋化因子受体CCR1和CCR4明显增加。椎间盘内压力和低氧环境对椎间盘干细胞响应趋化因子的能力有何影响，具体机制如何有待进一步研究。
三、压力和低氧等微环境下干细胞的自噬、凋亡、坏死性凋亡
椎间盘干细胞在不利微环境下损耗过多是椎间盘内干细胞数量和活性不易维持的重要因素。本课题组曾经系统报告压力对椎间盘内髓核细胞自噬、凋亡、坏死性凋亡等生物学行为的影响[12,26,27]。尽管有文献报道椎间盘干细胞较外源性MSC具有更强的耐受酸性、高渗等不利环境的能力[8]，但压力和低氧环境对椎间盘干细胞存活和（或）死亡的影响，以及椎间盘干细胞应对不利微环境直至死亡的机制还缺乏相关研究报告。
自噬是一种进化保守的溶酶体依赖性分解代谢途径，是维持干细胞内环境稳定的重要方式。本课题组曾经报告通过ROS-AKT-mTOR-AMPK通路活化细胞自噬，可减缓压力诱导髓核细胞损伤，但是过度压力可以通过依赖caspase途径及线粒体途径诱导髓核细胞发生凋亡、自噬性死亡[12,26]。低氧可以活化SCF/c-kit通路通过自噬平衡细胞存活与死亡之间关系从而提高MSCs的自我更新能力[28]，但压力和低氧等微环境下自噬对椎间盘干细胞生存的保护作用及调控机制未见文献报道。
细胞凋亡是为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序死亡。压力和低氧刺激均可诱导干细胞发生凋亡，如低氧可诱导MSC发生线粒体途径的凋亡[29]。我们曾报告压力可通过依赖caspase及线粒体途径诱导髓核细胞凋亡，且压力诱导的髓核细胞凋亡与髓核细胞自噬相互关联[12,26]。上述研究结果提示椎间盘干细胞内可能存在类似的自噬与凋亡关联现象（图3），其作用和机制有待进一步研究阐明。
图3
压力及低氧所致细胞自噬、凋亡和坏死性凋亡的部分信号通路示意图。HIF1α为缺氧诱导因子1α，BNIP3L/Nix为B淋巴细胞瘤-2/腺病毒E1B19kDa相关蛋白/NIP3样蛋白X，JNK为c-Jun氨基末端激酶又被称为应激活化蛋白激酶，Bcl2/Beclin1为B淋巴细胞瘤-2/自噬相关蛋白，Ca2+为钙离子，AMPK为AMP依赖的蛋白激酶,mTOR为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白，NF-κB为核因子κ-B
坏死性凋亡为一类具有坏死样形态学表现的程序性死亡，其在不利微环境下椎间盘干细胞数量减少中所起的作用也未见明确报告，仅有文献报道应用N-乙酰半胱氨酸和2-磷酸抗坏血酸酯可通过保护线粒体减少坏死性凋亡从而提高移植后MSC存活率[30]。在研究压力诱导髓核细胞死亡时，我们发现坏死性凋亡也参与压力诱导的髓核细胞死亡。椎间盘干细胞中坏死性凋亡是否扮演类似角色，有待进一步研究。
对MSC自噬、凋亡进行调控均可提高MSC生存率[31,32]。我们在研究压力诱导的髓核细胞自噬、凋亡和坏死性凋亡时却发现三者均参与压力诱导的髓核细胞死亡，且三者之间存在串扰关联。如坏死性凋亡抑制剂Nec-1能明显降低压力诱导的髓核细胞自噬，而自噬抑制剂3-MA对坏死性凋亡水平却无明显影响；自噬和凋亡之间存在着此消彼长的现象（图2）。这提示我们，在椎间盘内微环境下单一干预其中一种机制可能不足以持久、有效地提高椎间盘干细胞的存活率，有必要对三者进行综合研究，寻找恰当的调控靶点，甚至进行联合调控。
四、椎间盘干细胞迁移与自噬、凋亡、坏死性凋亡之间的关联
椎间盘干细胞向椎间盘内迁移减少和在微环境作用下死亡增加是椎间盘干细胞数量下降的两种重要机制，这两种机制之间可能存在相互关联。例如低氧环境下MSC通过HIF-1a-Twist信号通路下调E2A-p21表达从而维持干细胞活性[33]，通过HIF-1α/FASN/mTORC1信号通路促进MSC的增殖及迁移[34]；但在严重低氧环境下，干细胞通过调节GTP酶RhoA的活性使其迁移能力明显下降[35]。在其他组织内，干细胞自噬及干细胞内的非编码RNA与细胞迁移关系十分密切，如自噬激活剂可促进牙髓干细胞迁移，自噬抑制剂可明显抑制SDF-1α诱导的牙髓干细胞迁移[36]。miR-或miR-26过表达可以通过PI3K/Akt信号通路增加MSC的迁移[37]，miR-27a和miR-27b的过表达明显减少MSC迁移[38]。因此，可就这两种椎间盘干细胞数量下降的重要机制之间联系，如相关信号通路、miRNA等进行适当拓展研究，为退变治疗提供新的靶点。
五、水凝胶材料原位诱导髓核再生
为提高椎间盘干细胞治疗椎间盘退行性变的效率，除了维持椎间盘内干细胞数量，还需要募集更多的椎间盘干细胞，并原位诱导髓核再生。构建具有良好结构和生物学活性的组织工程学基质材料，为椎间盘干细胞提供良好的基质环境，是达到椎间盘退行性变有效治疗的重要条件[39,40,41]。多肽自组装纳米纤维凝胶材料是近年来组织工程领域的最新材料之一，已被用于细胞的三维培养、缺损组织的修复及药物和（或）细胞因子的缓释。研究表明功能材料的结构（如机械强度、超微结构等）越接近目标组织的结构越有利于细胞生物功能的发挥[22]。多肽水凝胶除具有传统材料无法比拟的优点（如模拟天然ECM超微纳米结构、高密度的功能性表位、可降解、无毒性及免疫原性等）外，其机械强度与凝胶状髓核组织的机械强度相近[42]。因此，多肽自组装纳米纤维水凝胶材料可能是髓核组织工程最有前途的支架材料。最新的研究发现多肽自组装水凝胶强度与其分子的骨架序列（如单链肽转换为分支肽）密切相关[43]。是否可以改变自组装多肽分子中的骨架序列以增加多肽自组装水凝胶的强度，构建更加适合于髓核组织工程的多肽自组装纳米纤维仿生材料是将来进一步研究的重点。
尽管干细胞本身可以向椎间盘内迁移，但其迁移效率和速度低下。研究发现细胞因子可以调控干细胞迁移。基质细胞衍生因子1α（stromalcell-derivedfactor-1α，SDF-1α）是一种由基质细胞分泌的具有优良生物学功能的生长因子。研究发现SDF-1α不仅可以诱导干细胞的迁移，且SDF-1可以和蛋白聚糖相互作用进而反馈调节SDF-1功能[44]。因此，水凝胶材料负载趋化因子等信号分子可能是未来椎间盘组织工程研究的趋势。
目前研究的瓶颈在于难以持续向椎间盘内提供数量充足且活性良好的干细胞。文献报道椎间盘内存在引导干细胞进行自我修复的机制，其主角是椎间盘干细胞，这些干细胞能响应环境因素对椎间盘的损伤，参与椎间盘的修复[45]。因此，通过移植负载趋化因子等活性分子的水凝胶材料至椎间盘，募集更多椎间盘干细胞进入髓核内，帮助其更好地适应椎间盘内微环境，并维持其良好状态及活性，最终实现原位诱导髓核再生，修复早期椎间盘退行性变。由于椎间盘干细胞研究还处于起步阶段，目前的研究仍存在一些局限性，如椎间盘干细胞在椎间盘内微环境下减少的机制还不清楚，影响椎间盘内干细胞分化的因素还不确定等，仍需进一步深入研究。
总之，椎间盘退行性变是一个复杂过程，干细胞治疗椎间盘退行性变是一种理想的手段，从椎间盘干细胞需要面临的微环境着手进一步研究椎间盘干细胞对刺激应答及数量减少的机制，继而采取针对性的干预措施，设计负载有信号分子的仿生多肽纳米支架材料，募集椎间盘内部干细胞诱导其归巢，原位诱导髓核组织再生。这将有望为椎间盘退行性变早期治疗提供理论依据及崭新的思路。
“参考文献略”
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